CRISPR/Cas9作為一種新型的基因編輯技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于多種物種的基因組編輯研究。由于低效率的同源重組修復(fù)及無法預(yù)期的編輯類型，CRISPR/Cas9技術(shù)多用于基因敲除的研究。目前，如何在細胞內(nèi)高效且特異地引入單核苷酸突變成為基因編輯的重大研究方向。

　　CRISPR/nCas9/dCas9技術(shù)融合胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯系統(tǒng)自研發(fā)以來被廣泛關(guān)注，該系統(tǒng)不需要產(chǎn)生DSB和提供DNA模板就能有效地替代基因組中的特定堿基。堿基編輯器包含Cas9蛋白變體、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）。

　　2019年5月22日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學棉花遺傳改良團隊題為"High Efficient and Precise Base Editing of C•G to T•A in the Allotetraploid Cotton（Gossypium hirsutum）Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System " 的研究論文，該論文利用Cas9缺口酶（nCas9），胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。實現(xiàn)了在棉花細胞內(nèi)高效且特異地引入單核苷酸突變，具有很高的C•Gto T•A 的單堿基編輯效率，并且可以進行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化。

　　在此之前，華中農(nóng)大棉花團隊已經(jīng)發(fā)表了3篇關(guān)于棉花基因編輯的研究論文，系統(tǒng)的對棉花中不同方式的基因編輯進行了研究：2017年發(fā)表的"High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton（Gossypium hirsutum）using CRISPR/Cas9system”論文中，介紹了國際上*早的棉花編輯系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)使用了棉花內(nèi)源的U6啟動子和合適的抗生素篩選標記，使得CRISPR/Cas9技術(shù)在異源四倍體棉花中的應(yīng)用具有高效特異的編輯；2018年發(fā)表了"Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants"，該論文利用高通量測序的方法，揭示了在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少，更多地是受體材料固有遺傳或/和體細胞無性系變異；2019年發(fā)表了Robust CRISPR/Cpf1 （ Cas12a ） mediated genome editing in allotetraploid cotton（G.hirsutum）"的研究論文，該論文分析了Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

　　在本研究中，作者利用Cas9缺口酶（nCas9），胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)（GhBE3）。選擇兩個內(nèi)源基因（GhCLA，GhPEBP），設(shè)計了三個靶標（sgRNA1，sgRNA2靶向GhCLA基因，sgRNA3靶向GhPEBP基因），構(gòu)建單堿基編輯載體并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行棉花遺傳轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)在棉花中靶標基因GhCLA，GhPEBP的三個靶標均被編輯，而且C-T的編輯效率達到57.78%，以靶標位點上多個C位點同時編輯為主；該系統(tǒng)在靶標序列上的“編輯窗口”為6個堿基（PAM序列遠端5'端3- 8的位置），且“編輯窗口”內(nèi)C-T替換效率在總DNA序列中達到18.63％，靶標序列編輯窗口內(nèi)的C-T編輯效率遠高于其余部位C-T替換的效率。

　　利用深測序檢測27個潛在脫靶位點，在潛在脫靶位點的編輯窗口內(nèi)發(fā)生C-T替換比例均低于0.1%，統(tǒng)計分析后堿基編輯的植株和野生植株沒有脫靶效率的差異。此外，將兩個GhCLA基因編輯的單株和一個野生（Jin668）植株進行100×深度的全基因組測序以檢測脫靶效應(yīng)。在從全基因組水平預(yù)測的1500個潛在脫靶位點上沒有發(fā)現(xiàn)脫靶突變，這表明單堿基編輯系統(tǒng)對棉花的基因組編輯具有較強的特異性。

　　該單堿基編輯系統(tǒng)系統(tǒng)在異源四倍體棉花中*應(yīng)用，具有較高的C•Gto T•A 的單堿基編輯效率和特異性，它將成為棉花功能基因組研究新的重要的技術(shù)手段。

　　華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室金雙俠教授為該論文的通訊作者，已畢業(yè)的碩士秦雷為*作者，張獻龍教授也參與了這項工作。該研究受到國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100203-9）和科技部轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化專項（2016ZX08010001-006）和中央高?？蒲薪?jīng)費（2013PY064，2662015PY028，2662015PY091 和0900206328）的支持。

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